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      核糖核酸/外泌體的應用
      2013-4-16  瀏覽量:6151

      核糖核酸/外泌體

       Veronica Dimuccio, Andrea Ranghino, Giovanni Camussi, and Benedetta Bussolati (2012) 正常尿液的外泌體隔離,計數和鑒定,Nephrol. Dial. Transplant. (2012) 27(suppl 2): ii3ii4 doi:10.1093/ndt/gfs196, FO010

      介紹和目的:外泌體是從不同類型的活化細胞分泌的微小囊泡。在腎臟中,外泌體主要由腎細胞釋放到尿液。最近的研究表明,外泌體表現表面受體,以及選定模式的mRNA和microRNA的細胞來源。因為尿液是一個現成的流體,它可能是被視為對腎狀態的理想信息來源。特別是外泌體似乎可完美反映腎臟不同部份的病理條件。從這個角度來看,外泌體的膜蛋白和RNA含量可能是腎臟病理的有用標記。本研究的目的是建立一個方案,用于外泌體的隔離,與及表面標記和微RNA(miRNA)的含量的定量和分析。

      方法:外泌體是從一批健康受試者的尿液中分離出來。在這項研究總共測試了四個外泌體隔離方案,基于1)超速離心(100.000克在4°C為1小時);2)納米膜濃縮器AMICON(100K);3)納米膜濃縮器Vivaspin 500(Sartorius); 4)及DTT(200mg/ml)變性TammHorsfall 蛋白質,然后超速離心。外泌體定量以Bradford蛋白質含量法,或以Nanosight計數。mRNA是使用mirVana試劑(Ambion)提取,miRNA以定量RT-PCR進行分析。由于外排體體積小于流式細胞術的靈敏度下限,流式細胞術在被隔離的囊泡吸附在4 Ym的醛硫酸乳膠珠后進行。

      結果:以方案2的方法,Bradford測試得出的蛋白質濃度表現出非常低的外泌體濃度。 Nanosight分析顯示,使用方案1和2得到高濃度的外泌體(4.7×108和3,5×108外泌體/毫升),而其它兩個方案則非常低。從方案1和2得到的外泌體中提取的RNA顯示20種miRNA的存在。流式細胞術配合乳膠顆粒的分析,是能夠識別的經典外泌體標記(CD63,CD24,CD9)以及腎細胞來源的標記(水信道蛋白,整合素,膜轉運蛋白)的存在。

      結論:在本研究中,我們確定基于超速離心獲得尿液中的外泌體是最合適的方案。比蛋白定量,Nanosight外泌體計數分析更為可靠,這可能是由于尿蛋白的污染。此外,使用乳膠顆粒為基礎的流式細胞儀分析,我們發現參與胞吐過程和腎細胞生理的正常尿液中的表面標志物外泌體和一系列miRNA可能與腎細胞功能相關。這些發現對各種各樣的腎病機理研究的進一步發展,可以是有效的起點。

       

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