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      RNA /外泌體/蛋白質/藥物輸送
      2013-4-17  瀏覽量:5850

      RNA /外泌體/蛋白質/藥物輸送

      Samir ElAndaloussi, Yi Lee, Samira LakhalLittleton, Jinghuan Li, Yiqi Seow, Chris Gardiner, Lydia AlvarezErviti, Ian L Sargent & Matthew J A Wood (2012) 外排體介導的siRNA在體外和體內的輸送Nature Protocols | Vol.7 No.12

      使用小干擾RNA(siRNA)誘導的基因靜默開辟了新藥物探索的途徑。然而,他們的治療潛力因不足的特定組織性輸送而受到阻礙。外排體是有希望打破不同生物性障礙的藥物輸送工具。在這里,我們展示了來源于培養細胞的外排體如何可以利用于體外和在體內的siRNAin輸送。這個方案首先描述通過轉染的表達載體產生針對性的外排體,包含融合了一個肽配體的外排體蛋白。然后,我們將解釋如何純化從轉染細胞培養上清中的外排體和找出其特征。接下來,我們詳細描述裝載siRNA在外排體中的關鍵步驟。最后,我們列出了如何使用外排體有效地在體內和體外在小老鼠腦中輸送siRNA。還提供了通過功能性化驗和成像技術而得到的預期結果例子及作出評價。整個方案需時約3周。

      納米粒子跟蹤分析 ●0.5小時
      (i)使用NIST可追溯的聚苯乙烯微球來確認粒徑測量。
      (ⅱ)即將使用前在PBS中稀釋外來體。通常情況下,初始稀釋1:100。如果有必要,調整外排體的懸浮液,實現外排體的計數在每毫升2×108至1.0×109之間。
      (ⅲ)將稀釋后的樣品加載樣品室,并按需要調整鏡頭對焦。外排體應該會出現為銳利的光點。
      (ⅳ)分析樣品,使用NTA的文字腳本控制儀器操作來預先記錄5個20秒的視頻,每個記錄之間有5秒的延遲。
      (v)目視檢查屏幕上的五個粒徑概況的一致性。如果不接近一致,重復測量。
      (vi)使用批量處理過程模式分析視頻,并將結果導出到Microsoft Excel。

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